晶体-细胞互相功效的蛋白质组学：肾结石研发的模型

Thongboonkerd V. Proteomics of Crystal-Cell Interactions: A Model for Kidney Stone Research. Cells. 2019 Sep 12;8(9):1076. doi: 10.3390/cells8091076. PMID: 31547429; PMCID: PMC6769877.

晶体-细胞互相功效的蛋白质组学：肾结石研发的模型

肾结石/尿石症（即肾结石病）仍旧是1个世界公共卫生问题，发病率/抱病率不停升高。肾结石最常见的化学成份是草酸钙，它通过结晶、晶体生长、晶体集结、晶体细胞粘拥护通过肾间质中的细胞外基质侵入来激发结石生成。在这类流程中，晶体 - 细胞互相功效（定论为“细胞通过粘附在细胞外表或内化到细胞中的晶体的任意方法的牵连而变化细胞的情况，随同着晶体的改变，比如，细胞诱导的生长，粘合本领，降解等”）针对晶体在肾脏中的保留十分首要。在过去的12年中，蛋白质组学已全面运用于肾结石研发，旨在更好地了解肾结石生成的致病体制。本文概括了该行业的当下常识，并总结了从一切将蛋白质组学运用于晶体 - 细胞互相功效研发的研发中获取的信息，这类研发随后造成了性能研发，以处理表示蛋白质组学信息在肾结石重病发病体制中的显着牵连或性能功效。

1. 引言

肾结石病仍旧是一类常见的人类重病，在世界发达国度和成长中国度都能够搜到[1，2，3]。肾结石首要由含钙晶体构成，特别是草酸钙（CaOx）一水合物（COM）和二水合钙（COD）[1，2，3]。肾结石生成的体制流程相当高难，牵扯结晶、晶体生长、晶体集结、晶体细胞粘附并且通过肾间质中的细胞外基质（ECM）侵入晶体[4，5，6]。结晶既能够在肾小管内（管内模型）内产生，也能够产生在肾间质（兰德尔斑块模型）[4，5，6]。晶体生成后，单个晶体通过晶体生长或集结体制变成较大的颗粒[7，8]。另外，晶体-细胞粘附造成晶体潴留到肾小管或间质内[9，10]。粘附的晶体能够内化到肾小管细胞中进行降解，反之亦然，通过炎症级联反应进一步加强结石生成流程[11，12]。最终，在肾间质中生成的内化晶体能够应用纤溶酶-纤溶酶原途径[13]通过ECM侵入或迁移到其余部位，随后激发组织炎症和腐蚀[14，15]。

有趣的是，晶体保留和结石生成的要害流程之一是晶体 - 细胞粘附方法，须要“晶体 - 细胞互相功效”，这能够在这里定论为细胞被粘附在细胞外表或内化到细胞中的晶体的任意牵连而变化的情况， 随同着晶体的改变，比如，细胞诱导的生长、粘合本领、降解等。应用术语“互相功效”是通过晶体和细胞之间的“互相功效”来逻辑的。很显著，晶体能够引发细胞中的不少改变，从轻度到重度细胞毒性[14，15，16]。另一方面，细胞的构成，特别是在顶端外表和内吞囊泡中，会牵连晶体的生长，粘合本领和降解[17，18]。这类互相功效能够加强肾内晶体的保留和晶体加入肾小管细胞的内吞功效。另外，晶体-细胞互相功效也可造成肾小管细胞伤害和炎症级联反应，进而进一步加强结石生成流程[14，15，16]。

在蛋白质组学世纪，蛋白质组学已被全面运用于各类肾脏重病[19，20，21]。在过去的12年中，蛋白质组学已全面运用于肾结石重病（特别是COM和COD型号）的研发，旨在更好地了解肾结石生成的致病体制[22，23]。本文总结了一切将蛋白质组学运用于晶体 - 细胞互相功效研发的研发，这类研发随后造成了性能研发，以处理表示蛋白质组学信息在肾结石重病发病体制中的显着牵连或性能功效。请注重，这类研发运用蛋白质组学从结石生成者中判定尿液或肾结石基质中的蛋白质，而没有任意证据标明“晶体 - 细胞互相功效”（见上面的定论），被消除在本评估之外（由于此中不少蛋白质不过与尿液中的结石调整剂混合，或者不过在结石肿大时期通过窒碍卡在结石基质内，但在结石发病体制中没有任意功效）。肾结石研发中与CaOx晶体 - 细胞互相功效的蛋白质组学有关的一切有关研发总结在表 1并研讨如下。

表 1 与CaOx晶体 - 细胞互相功效的蛋白质组学有关的一切有关研发摘要。年作家/考虑文献晶体-细胞互相功效的前提蛋白质组学技术/性能探测首要发掘不同剂量和型号的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的牵连2008塞曼戈恩等 [24]细胞：MDCK细胞 （全细胞）晶体：100 μg/mL COM养成：48 小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱11种上浮和5种下调蛋白质，在转录/翻译，信号转导，细胞代谢和生长，核和细胞构造，运输，应激反应和生物合成中阐扬功效。2008通布克德五世等 [25]]细胞：MDCK细胞（全细胞）晶体：1000 μg/mL COM 孵育：48 小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱判定出25种上浮和23种下调蛋白质。当伴侣被上浮时，参加蛋白质合成，细胞周期调整，细胞构造和细胞信号传导的其余蛋白质被下调。2008塞曼戈恩T等[26]细胞：MDCK细胞（全细胞）晶体：100 μg/mL COD孵育：48 小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱5种上浮和5种下调蛋白质，操控细胞代谢，构造，完好性，信号转导和应激反应。2010陈 S 等 [27]]细胞：HK-2 细胞 （全细胞）晶体：200 μg/mL COM养成：12 小时2-DE 银二胺染色， LC-静电放电微粒/微粒9种上浮和3种下调蛋白质，在能量构成，细胞增殖，细胞凋亡，应激反应，钙平衡和蛋白质合成中起功效。2011蒋宗华等 [28]细胞：MDCK细胞（全细胞）晶体：100 μg/mL COD孵育：48 小时2-DE、Pro-Q 祖母绿糖蛋白染色、西普罗红宝石总蛋白染色、Q-TOF 质谱和质谱/质谱在16种明显变化的糖蛋白中，3个蛋白酶体亚基的糖型上浮，而肌动蛋白有关蛋白3（ARP3）的糖型下调。2012柴亚里特 S 等 [29]细胞：MDCK细胞（纯化的线粒体）晶体：100微克/毫升COM孵育：48小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱，氧合分印迹测定12种上浮和3种下调线粒体蛋白，调整细胞构造，新陈代谢和能量构成。COM晶体还诱导线粒体性能阻碍和氧化润饰蛋白在细胞中的沉淀。2017维奈法特A等 [30]细胞：MDCK细胞 （全细胞）晶体：100/1000 μg/mL COD/COM养成：48 小时蛋白质-蛋白质互相功效网络解析，荧光素 - 荧光素酶ATP测定，氧化印迹测定，泛素化蛋白质的丈量，细胞灭亡测定和晶体 - 细胞粘附测定与低剂量相比，高剂量的这类晶体引发细胞蛋白质组更显著的改变，以及COM比COD更有效地诱导细胞蛋白质组的变化。用高剂量解决的细胞拥有更高程度的细胞内ATP，氧化润饰蛋白和细胞灭亡，但泛素化蛋白程度过低。COM也诱发比COD更严重的细胞毒性。用抗氧化剂EGCG对细胞进行预解决能够减低晶体诱导的氧化润饰蛋白的沉淀和细胞的晶体结合本领。2018皮拉彭 P 等 [31]]细胞：MDCK细胞（全细胞）晶体：1000 μg/mL COM 孵育：48 小时蛋白质-蛋白质互相功效网络解析、增殖测定、伤口愈合测定、氧化印迹测定、荧光素-荧光素酶 ATP 测定和经上皮耐药性 （TER） 丈量用1000μg/ mL COM晶体解决的细胞毒性细胞在细胞增殖，伤口愈合本领，TER并且慎密连通蛋白zonula闭塞-1（ZO-1）和信号蛋白RhoA的程度方面存在减低。相同，细胞内ATP和氧化润饰蛋白的程度上升。肾小管细胞顶端外表COM晶体受体的蛋白质组判定2011方恩根等 [32]细胞：MDCK细胞 （纯化的顶端膜）晶体：COM孵育：过夜甲基纤维素/质谱、Q-TOF 质谱和质谱/质谱、晶体细胞粘附测定、抗体中和测定共判定出96个潜在的COM晶体受体。膜联蛋白II成为COM晶体受体的功效通过应用特同性抗体的中和测定获得证明。2012舒替蓬坦酸 S 等 [33]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM孵育：30分钟，72小时2-DE、西普鲁比红宝石染色、Q-TOF 质谱和质谱解析、晶体-细胞粘附测定、钙诱导测定、抗体中和测定膜联蛋白A1成为COM晶体受体。2013坎拉亚 R 等 [34]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM养成：30分钟，72小时2-DE、西普罗红宝石染色、Q-TOF 质谱和质谱/质谱、晶体细胞粘附测定、草酸盐诱导实验、抗体中和测定A-烯醇化酶成为COM晶体受体。2016皮拉彭 P 等 [35]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM孵育：30分钟晶体-细胞粘附测定、钙诱导测定膜联蛋白A1成为COM晶体受体。2016方恩根等 [36]细胞：MDCK细胞（全部细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM孵育：1小时晶体细胞粘附测定、抗体中和测定A-烯醇化酶成为COM晶体受体。2016方恩根等 [37]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM养成：1小时，48小时晶体-细胞粘附测定、晶体内化测定、抗体中和测定、小烦扰RNA（siRNA）敲低蛋白质HSP90用作COM晶体受体。2016马尼索恩 J 等 [38]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM孵育：30分钟晶体-细胞粘附测定、蛋白质过表示、草酸盐诱导测定A-微管蛋白过表示造成三类COM晶体受体的下调，含盖α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并减低了细胞的晶体结合本领。2016彭萨库尔 N 等 [39]]细胞：MDCK细胞（全细胞）晶体：100 μg/mL COM孵育：30 分钟晶体-细胞粘附测定、siRNA 蛋白质敲低、草酸盐诱导测定层粘连蛋白A / C敲低造成四种COM晶体受体的程度减低，含盖维生素A，α烯醇化酶，S100和膜联蛋白A2，以及细胞的晶体结合本领下落。2018马尼索恩 J 等 [40]]细胞：HEK293T 细胞 （全细胞）晶体：100 μg/mL COM养成：1 小时晶体-细胞粘附测定，通过siRNA敲低蛋白质HSP90用作COM晶体受体。2018维奈法特A等 [41]细胞：MDCK细胞（全部细胞和纯化的顶膜）晶体：100μg/mL COM孵育：1小时晶体-细胞粘附测定、晶体内化测定、抗体中和测定PMCA2用作COM晶体受体。COM晶体对单核细胞和巨噬细胞细胞蛋白质组的牵连2010辛格托N等[42]细胞：U937 细胞 （全细胞）晶体：100 μg/mL COM养成：24 小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱9种上浮蛋白质和13种下调蛋白质，在细胞周期，细胞构造，碳水化合物代谢，脂质代谢，mRNA加工并且蛋白质合成，安稳和降解中起功效。2013辛格托N等[43]]细胞：人巨噬细胞（全细胞）晶体：100μg/mL COM孵育：24小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱，吞噬功效测定，通过 SIRNA 敲低蛋白质7种上浮和7种下调蛋白质，操控细胞构造，碳水化合物代谢，DNA / RNA加工，蛋白质代谢，分子运输和应激反应。HSP90在巨噬细胞的吞噬体生成和吞噬活性中起着至关首要的功效。COM晶体对排泄组和外泌体蛋白质组的牵连2016蒋宗华等 [13]细胞：MDCK细胞（排泄组）晶体：100 μg/mL COM养成：20 小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS / MS，晶体迁移测定，细胞迁移测定COM晶体诱导2个来自肾小管细胞的排泄蛋白加大和4个减小。排泄性烯醇化酶-1的加大反过来又通过ECM加强了COM晶体的侵入。2016辛提普伦格拉特 K 等 [44]]细胞：U937 细胞（排泄组）晶体：100 μg/mL COM孵育：16 小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF 质谱和质谱/质谱COM晶体诱导了14个与U937单核细胞免疫反应和细胞存活有关的排泄蛋白加大和4个减小。加大的HSP90限于于细胞外表。2018辛格托N等[45]细胞：人巨噬细胞（外泌体）晶体：100 μg/mL COM孵育：24小时2-DE，深紫色染色，纳米LC-ESI-ETD MS / MS，细胞迁移测定，吞噬功效测定，通过siRNA敲低蛋白质2种上浮和4种下调外泌体蛋白。来自晶体互相功效的巨噬细胞的外泌体诱导单核细胞的迁移/活化和巨噬细胞的吞噬活性。siRNA敲低了维生素素，顺利地抑止了来自COM晶体表露巨噬细胞的外泌体的这类功效。2018辛格托N等[46]细胞：人巨噬细胞（外泌体）晶体：100 μg/mL COM孵育：24小时纳米LC-ESI-Qq-TOF，细胞迁移实验，晶体结合实验，晶体迁移实验7种上浮和19种下调外泌体蛋白。来自晶体互相功效巨噬细胞的外泌体诱导中性粒细胞迁移，加强肾小管细胞中促炎细胞因子IL-8的构成，与COM晶体拥有更大的结合本领，并通过ECM激活晶体入侵。

2. 不同剂量和型号的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的牵连

运用于晶体 - 细胞互相功效的蛋白质组学的初次研发是在2008年完结的[24]。在这项工作中，认真创建了研发模型，标明剂量为100μg/ mL（每体积养成基）的COM晶体在48小时的埋伏期不会对肾小管细胞导致严重的细胞毒性，以及细胞灭亡百分比不会加大。因而，由COM晶体诱导的细胞蛋白质组的改变反映了细胞对COM晶体的反应，而不是它们的细胞毒性功效。另外，扫描电子显微镜（SEM）在与细胞孵育后显现出COM晶体边缘的变形，初次标明晶体 - 细胞互相功效拥有直接的试验证据。应用二维凝胶电泳（2-DE）与Sypro Ruby荧光染色，接着进行四极杆飞翔时间（Q-TOF）质谱（MS）和串联MS（MS / MS），判定了11种上浮和5种下调蛋白质，它们在转录/翻译，信号转导，细胞代谢和生长，核和细胞构造，运输，应激反应和生物合成中起功效。此中许多蛋白质组学信息通过二维（2-D）蛋白质印迹获得证明[24]。

随后，进行了一项亚细胞蛋白质组研发[29]，以评价100μg/mL COM晶体对线粒体蛋白质组的牵连并且应用高度纯化的线粒体分离方式表露于晶体48小时的肾小管细胞的性能[47]。应用2-DE与深紫色荧光染色的较为解析，接着是Q-TOF MS和MS / MS解析，确认了12种上浮和3种下调线粒体蛋白，它们调整细胞构造，代谢和能量构成。另外，Oxyblot探测标明，COM晶体诱导线粒体性能阻碍和氧化润饰蛋白在细胞中的沉淀[29]。

另一项应用很高剂量（200 μg/mL）COM晶体的研发显现，当肾小管细胞与COM晶体和2 mM草酸盐一块孵育较短时间（仅12小时）时，细胞灭亡不会加大[27]。应用2-DE银染色，接着液相色谱法结合电喷雾电离MS / MS（LC-ESI MS / MS），信息显现9种上浮和3种下调细胞蛋白，其功效于能量构成，细胞增殖，凋亡，应激反应，钙平衡和蛋白质合成。

应用高得多剂量（1000 μg/mL）的COM晶体，细胞在与晶体孵育48小时后，细胞产生严重细胞毒性，总细胞灭亡加大[25]。应用2-DE与西普罗红宝石染色，接着进行Q-TOF MS和MS / MS解析，判定出25种上浮和23种下调蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜联蛋白-A1程度的减低通过2-D蛋白质印迹获得证明。有趣的是，伴侣被上浮，而其余参加蛋白质合成、细胞周期调控、细胞构造和细胞信号传导的蛋白质被下调[25]。较近应用各类测定方式进行了性能研发，以确认该表示蛋白质组学信息集的生物学有关性[31]。最初，一切显着变化的蛋白质被提交达STRING生物数据学工具[48]以获取蛋白质 - 蛋白质互相功效网络，其揭露了细胞增殖/伤口愈合，氧化应激/线粒体性能并且细胞连通复合物/完好性是显着变化蛋白质的首要生物学性能。验证明验标明，用1000 μg/mL COM晶体解决的细胞毒性肾小管细胞在细胞增殖、伤口愈合本领、经上皮阻力（TER）并且闭塞-1（ZO-1）和信号蛋白RhoA的慎密连通蛋白程度方面均有所下落。相同，氧化润饰蛋白的程度上升。固然ATP合酶α亚基前体减小，但参加能量构成和稳态的其余线粒体蛋白（比如乌头酶、腺苷酸激酶2、泛醇-细胞色素-c复原酶）加大[25]。结果，COM解决的细胞中的细胞内ATP程度上升[31]。这类信息也许反映了COM晶体诱导的微管毒性时期产生的细胞流程[31]。

蛋白质组学还运用于研发表露于无毒剂量（100μg/mL）的COD晶体48小时后肾小管细胞细胞蛋白质组的改变[26]。应用2-DE和Sypro Ruby染色，接着进行Q-TOF MS和MS/MS解析，信息显现5种上浮和5种下调蛋白质操控细胞代谢、构造、完好性、信号转导和应激反应[26]。随后，研发了100 μg/mL COD晶体诱导的肾小管细胞糖蛋白组的改变[28]。应用2-DE和Pro-Q祖母绿糖蛋白染色，接着应用Sypro Ruby总蛋白染色进行归一化，Q-TOF MS和MS / MS判定了16个显着变化的糖蛋白，含盖负担调整细胞 - 细胞解离的3个蛋白酶体亚基的糖型和在细胞完好性中起功效的肌动蛋白有关蛋白3（ARP3）。这类信息标明，COD晶体造成细胞解离并减低细胞完好性[28]。

另外，还对表露于不同剂量和型号的CaOx晶体后肾小管细胞的性能扰动进行了较为解析[30]。表示信息的较为标明，与低剂量相比，这类晶体的高剂量引发细胞蛋白质组更显著的改变，以及COM比COD更有效地诱导细胞蛋白质组的变化。性能解析显现，在用高剂量COM和COD解决的细胞中，细胞内ATP，氧化润饰蛋白和细胞灭亡程度很高，但泛素化蛋白程度过低。COM晶体也诱导比COD更严重的细胞毒性。用抗氧化剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对细胞进行预解决能够减低晶体诱导的氧化润饰蛋白的沉淀和细胞的晶体结合本领。这类信息注重了高剂量与低剂量并且COM与COD晶体在肾小管细胞中诱导性能性扰动的差别效应。研发结果还标明，氧化应激也许在用这类不同剂量/型号的晶体解决的细胞的晶体结合本领中起首要功效[30]。

但是，理应注重的是，COM / COD晶体的剂量及其表露于一切上述体外研发中运用的细胞的时间也许并非完全代表结石成型剂中的体内情况，这也许随同着肾结石发病体制的另1个模型，即Randall的斑块模型。现在，晶体 - 细胞互相功效的体内研发仿佛尚未用来肾结石研发，由于限定（实际上缺少）追踪体内晶体 - 细胞互相功效的技术。当这类技术可用时，肾结石生成的致病体制将愈加清楚。

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3. 肾小管细胞顶端外表COM晶体受体的蛋白质组学判定

肾结石研发在细胞程度上获得重要飞跃的另一步是开发一类简洁但有效的剥离方式来分离和纯化极化肾小管细胞的顶膜[49]。这类新方式首要依托于所加以的外表（比如，Whatman滤纸，硝酸纤维素膜，玻璃纸或玻璃盖玻片）的吸附本领，以借用这类外表和顶端膜之间的含水亲和力和离子互相功效与顶端膜粘附。在测验的这4个外表中，滤纸是分离和纯化顶端膜的最有效一类，而基底外侧膜蛋白没有任意污染，这已通过免疫印迹和免疫荧光染色证明[49]。与传统的生化测定（首要应用基于离心的方式）相比，剥离方式在分离/纯化顶端膜方面要有效得多。

该剥离方式用来分离极化肾小管细胞顶膜的高度纯化部份，接着判定细胞外表的潜在COM晶体受体[32]。将回收的蛋白质重悬于人工尿液中，并和COM晶体一块孵育过夜。洗涤和洗脱后，凝胶加强液相色谱法，接着串联MS（GeLC-MS / MS）共判定出96个潜在的COM晶体受体。此中，膜联蛋白II成为COM晶体受体的功效通过晶体-细胞粘附实验验证，接着应用特同性抗膜联蛋白II抗体进行中和[32]。另外，其余COM晶体受体也在随后的研发中获得证明，含盖α烯醇化酶[34，36]、膜联蛋白A1[33，35]、热休克蛋白90（HSP90）[37，40]和质膜Ca2+异肽酶 2 （PMCA2） [41]。

其余不成为COM晶体受体但其功效与各类COM晶体受体有关的蛋白质，含盖α-微管蛋白和层粘连蛋白A / C.A-微管蛋白（一类细胞骨架蛋白）被判定为应用蛋白质组学方式用1000μg/mL COM晶体解决的肾小管细胞中的下调蛋白质之一[25]，并成为蛋白质 - 蛋白质互相功效网络的核心节点[38]].α-微管蛋白的过表示造成3种COM晶体受体的下调，含盖α烯醇化酶、热休克蛋白70（HSP70）和HSP90，以及细胞的晶体结合本领下落[38]。相比之下，另一项蛋白质组学研发发掘，层粘连蛋白A/C（一类核层蛋白）是用100 μg/mL COM晶体解决的肾小管细胞中的上浮蛋白质之一[24]，并成为蛋白质-蛋白质互相功效网络的核心节点[39]。小烦扰RNA（siRNA）敲低层粘连蛋白A/C造成4种COM晶体受体（含盖维门汀、α烯醇化酶、S100和膜联蛋白A2）的程度减低，以及细胞的晶体结合本领下落[39]。这类信息标明，层粘连蛋白A / C拥有各类性能，含盖调整其余蛋白质的表示。对上述COM晶体受体及其调整剂或有关蛋白质的表征也许造成进一步成长方略，通过阻断COM晶体粘附在细胞上和晶体保留在肾内来防范肾结石的生成。

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4. COM晶体对单核细胞和巨噬细胞细胞蛋白质组的牵连

CaOx晶体不单与肾小管细胞互相功效，还与单核细胞和巨噬细胞互相功效，它们在进一步加剧肾结石生成的炎症流程中起首要功效。因而，蛋白质组研发已然研发了单核细胞/巨噬细胞呼应COM晶体的功效。将人单核细胞U937细胞与100μg/mL COM晶体一块孵育24小时，并检验细胞蛋白质组的改变[42]。应用2-DE进行深紫色荧光染色，接着进行Q-TOF MS和MS/MS解析，结果显现9种蛋白质的程度上升，13种蛋白质的程度减低，这类蛋白质在细胞周期、细胞构造、碳水化合物代谢、脂质代谢、mRNA加工并且蛋白质合成、安稳和降解中的功效[42]。

起初，采取相似的方式研发人巨噬细胞与100μg/mL COM晶体互相功效24小时后细胞蛋白质组的改变[43]。较为蛋白质组解析揭露了7种上浮和7种下调蛋白质，它们操控细胞构造，碳水化合物代谢，DNA / RNA加工，蛋白质代谢，分子运输和应激反应。有趣的是，蛋白-蛋白互相功效网络解析标明，HSP90直接与β肌动蛋白和α微管蛋白互相功效，一切这类互相功效的同伴在COM解决的巨噬细胞中都上浮。性能研发标明，唯独肌动蛋白与HSP90共定位在被吞噬的COM晶体周边，生成吞噬体构造。siRNA对HSP90的敲低抑止了吞噬体的生成并且COM晶体诱导的巨噬细胞的吞噬和迁移活性。这类信息标明，HSP90不单成为COM晶体受体，况且在巨噬细胞的吞噬体生成和吞噬活性中也起着至关首要的功效[43]。

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5. COM晶体对排泄组和外泌体蛋白质组的牵连

除了COM晶体诱导的细胞蛋白质组的变化外，还应用蛋白质组学方式研发了晶体 - 细胞互相功效对排泄组的牵连。针对肾小管细胞，100 μg/mL COM晶体造成2种排泄蛋白程度上升，4种排泄蛋白程度减低[13]。有趣的是，应用先前创建的基于纤溶酶原-纤溶酶活性的晶体迁移测定法进行了性能研发[50]。信息显现，排泄性烯醇化酶-1的加大反过来又通过ECM督促COM晶体侵蚀和单核细胞的迁移[13]。针对人单核细胞，用U937单核细胞孵育100μg/mL COM晶体16 h可诱导细胞中14个排泄蛋白加大和4个减小[44]。有趣的是，一项免疫荧光研发探测到细胞外表的HSP90加大，这标明其加大的排泄也许来自非经典排泄途径[44]。

为了证明COM能够通过非经典排泄途径诱导排泄组的改变，随后的研发调研了来自人类巨噬细胞的外泌体蛋白质组的变化。应用基于凝胶的[45]和无凝胶[46]定量蛋白质组学方式，判定出不少显着变化的外泌体蛋白。有趣的是，表露于COM晶体的巨噬细胞构成更高程度的白细胞介素-1β（IL-1β），这是炎症小体活化标注物之一[51，52]。另外，来自这类晶体互相功效巨噬细胞的外泌体诱导单核细胞的迁移/活化，单核细胞构成更高程度的白细胞介素-8（IL-8）（一类促炎细胞因子），其成为旁排泄激活巨噬细胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一类上浮蛋白（维门汀），顺利地抑止了来自COM晶体表露巨噬细胞的外泌体的这类功效[45]。另外，来自这类晶体互相功效巨噬细胞的外泌体诱导中性粒细胞迁移，加强肾小管细胞中促炎细胞因子IL-8的构成，与COM晶体的结合本领更强，并通过ECM激活晶体入侵[46]。

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6. 论断

在过去的12年中，蛋白质组学已顺利运用于肾结石研发，旨在更好地了解肾结石生成的致病体制，特别是在晶体 - 细胞互相功效（表 1).这类研发的第一阶段首要牵扯与COM晶体互相功效后肾小管细胞中变化的全细胞蛋白质组的表征。随后，亚细胞蛋白质组学揭露了细胞与COM晶体互相功效后线粒体蛋白质组改变和线粒体性能阻碍的其余数据。另外，对不同剂量和型号的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的牵连的性能研发，促使更好地解读受晶体 - 细胞互相功效牵连的肾小管细胞的表示和性能扰动（见第2节）。在开发出一类简洁而高效的方式来从极化的肾小管细胞中纯化顶膜以后，该行业产生了1个较大的飞跃。特别是，蛋白质组学判定了批量潜在的COM晶体受体，接着在随后的几项研发中进行了性能验证。这类发掘针对进一步制订通过阻断致病晶体与靶肾小管细胞之间的结合来防备肾结石生成的方略十分首要（见第3节）。除肾小管细胞外，蛋白质组学还运用于研发人单核细胞/巨噬细胞细胞蛋白质组的改变，这类改变造成更清晰地了解解除粘拥护内化CaOx晶体和炎症反应的体制（见第4节）。另外，还开发了几种性能测定方式，以处理从蛋白质组学研发的初始阶段判定的表示信息的性能意思。比如，判定由COM晶体诱导的变化的排泄蛋白，这反过来又加重了通过ECM的晶体入侵。最终，较近对于巨噬细胞外泌体在肾结石生成炎症级联中的功效的常识供应了额外的新数据，以更好地了解晶体 - 细胞互相功效时期的炎症级联反应（见第5节）。综上所述，一切这类发掘都有助于更好地了解肾结石病的致病体制，特别是在晶体 - 细胞互相功效的方法中。另外，这类发掘还也许造成开发新的方略来防备新的和/或复发的肾结石的生成。